建立間接的ELISA方法適合己烯雌酚樣本快速檢測

己烯雌酚（diethylstibestrol, DES）是一種人工合成的雌激素,在促進動物蛋白質(zhì)的合成代謝、提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯,因此一直被作為一種動物生長促進劑用于畜禽以及水產(chǎn)品養(yǎng)殖中。癌癥研究機構(gòu)（IARC）研究發(fā)現(xiàn),DES是一種致癌物質(zhì),能夠在動物源性食品如肝臟、肌肉、蛋、奶中殘留,并通過食物鏈危害人體健康。因此世界各國規(guī)定食品動物養(yǎng)殖中不得以任何途徑和方式使用DES,養(yǎng)殖動物及動物性食品中不得檢出DES。 本論文針對DES的結(jié)構(gòu)特點,設(shè)計并合成了DES半抗原和人工抗原,并對DES半抗原和人工抗原進行了表征和鑒定,制備出了己烯雌酚的高質(zhì)量的多克隆抗體,應用間接ELISA方法和Western Blot測定了抗體的特異性,建立了己烯雌酚的酶聯(lián)免疫檢測方法以及相應的樣品提取方法,并且用HPLC方法對ELISA檢測方法的精密度和準確度進行了驗證。 本文分兩部分,*部分對己烯雌酚進行了結(jié)構(gòu)修飾,用有機合成方法合成了己烯雌酚-單-羧基丙基-醚（DES-MCPE）和己烯雌酚半琥珀酸（DES-HS）,并通過紅外、質(zhì)譜和核磁共振對合成產(chǎn)物進行了鑒定之后分別將己烯雌酚衍生產(chǎn)物利用優(yōu)化的混合酸酐法、碳二亞胺法與牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián),分別作為免疫抗原及包被抗原,并且通過紫外掃描光譜、SDS-PAGE電泳試驗驗證偶聯(lián)效果。 第二部分,以合成的DES-HS-BSA, DES-MCPE-BSA免疫新西蘭大白兔得到抗血清,優(yōu)化抗體純化條件,得到DES抗體,應用Western Blot和間接ELISA法驗證了抗體的特異性；探討了間接ELISA測定DES抗體的條件；并對DES抗體與游離DES的特異性結(jié)合反應進行測定。采用碳二亞胺法連接的DES-HS-BSA作為免疫原得到的抗體進行間接競爭ELISA實驗,優(yōu)化了ELISA工作條件,建立了間接競爭ELISA檢測DES方法。方陣滴定法確定*OVA-HS-HSA包被抗原的濃度為2.5μg/mLDES-HS-BSA,酶標二抗（羊抗兔IgG-HRP）工作濃度為1：7500以及抗體的工作濃度為1：6400。以上述試驗條件為基礎(chǔ),以系列稀釋的DES標準溶液作為檢測對象,繪制標準曲線,得到的線性回歸直線方程為y=-2.6679x+3.0589,相關(guān)系數(shù)R2=0.9969,從標準曲線可以得知,此方法可測定的zui適范圍為Ong/mL～100ng/mL,zui小檢測限約為8.4ng/mL。本實驗所建立的ELISA方法的度以批內(nèi)誤差表示,結(jié)果表明孔間差異2.57%（n=5）,度較好。在可測定濃度范圍內(nèi)己烯雌酚（DES）抗體與其他二苯乙烯類激素免疫交叉反應較小,在添加回收實驗中,對豬肉樣本在10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL三個濃度的平均回收率為109.41%。實驗結(jié)果表明所建立的間接ELISA方法有較高特異性和選擇性,適合己烯雌酚藥物殘留樣本快速檢測。

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