激光掃描共焦顯微鏡（LSCM）是八十年代問世的一種新型分析儀器，由于其高分辨率，高靈敏度，高放大率等特點，在細胞水平上能作多種功能測量和分析，成為分析細胞學(xué)的重要研究工具，激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)而形成的新型顯微鏡。它對活細胞分層掃描后得到光學(xué)切片，可進行細胞三維重建。測量分析細胞形態(tài)學(xué)參數(shù)和熒光強度。利用熒光探針標(biāo)記LSCM可以對細胞內(nèi)微細結(jié)構(gòu)和離子的動態(tài)變化進行定性、定量、定時和定位分析。LSCM可以進行顯微手術(shù)，細胞分選，細胞胞間通訊和膜的流動性等測量。它的應(yīng)用前景非常廣泛，將為生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的科研工作提供新的手段。
激光掃描共焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM），有時也被稱為激光掃描細胞儀（Laser Scanning Cytometer，LSC）是八十年代迅速發(fā)展起來的用于分析細胞學(xué)的新型儀器。LSCM與普通光學(xué)顯微鏡相比優(yōu)點明顯，分辨率、靈敏度、放大率和熒光檢測信噪比大大提高。對活細胞可以做分層掃描后，進行三維重建和測量分析，對細胞內(nèi)微細結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化可進行定性、定量、定時和定位分析檢測，可通過熒光標(biāo)記檢測細胞內(nèi)離子濃度的變化比例及動態(tài)變化。因此LSCM是細胞神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)，藥物學(xué)及遺傳學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新一代研究工具。
1．LSCM的發(fā)展簡況 Simple development of laser scanning confocal microscope
激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)而形成的新型顯微鏡。1971年美國Davidovits和Egger發(fā)明了以激光為光源的透鏡掃描系統(tǒng)，1978年Sheppard等推出了載物臺掃描裝置。1979年有了樣品掃描裝置，1980年Koestert等介紹了鏡掃描系統(tǒng)，1983到1986年，Aslund和Carlsson等介紹了雙鏡掃描系統(tǒng)和共軛聚焦成象系統(tǒng)。1984年*臺LSCM實用產(chǎn)品問世，十多年來LSCM的應(yīng)用有了飛速發(fā)展。我國在1990年引進五臺LSCM，到了1997年已有了三十多臺設(shè)備。產(chǎn)品主要來自四家公司，美國的Bio－Rad和Meridian公司，德國的Zeiss和Leica公司。
2．LSCM的基本原理 Principle of laser scanning confocal microscope
普通光學(xué)顯微鏡使用的鹵素?zé)艄庠礊榛旌瞎?，光譜范圍寬，成象時樣品上每個照光點均會受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量，LSCM結(jié)構(gòu)上采用雙針孔（Pinhole）裝置，形成物象共軛的*設(shè)計，激光經(jīng)物鏡焦平面上針孔形成點光源對樣品掃描，于測量透鏡焦平面的探測針孔處經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測量光點形成的雜散熒光和樣品不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。這是因為光學(xué)系統(tǒng)物象共軛，只有物鏡焦平面上的點經(jīng)針孔空間濾波才能形成光點圖象，掃描后可得到信噪比*的光學(xué)橫斷面，分辨率比普通光學(xué)顯微鏡提高1.4倍。LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強度測量，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，這種功能被形象的稱為"顯微CT"。
3．LSCM的結(jié)構(gòu)特點 Structure of laser scanning confocal microscope
LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。常用計算機為奔騰系列，內(nèi)存是64MB，以便于圖像的存取和運算，軟件界面多數(shù)為Windows或Windows NT，后者圖象采集效率更高，軟件也可在互聯(lián)網(wǎng)上方便地更新。
3.1 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)
顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成象質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在活細胞檢測等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。顯微鏡光路以無限遠光學(xué)系統(tǒng)為佳，可方便地在其中插人光學(xué)選件而不影響成象質(zhì)量和測量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場復(fù)消色 差物鏡為好，有利于熒光的采集和成象的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺的移動調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計算機自動控制。多功能顯微鏡以德國的蔡司Zeiss和萊卡Leica的產(chǎn)品為好，也常用日本的尼康Nikon或奧林巴斯Olympus產(chǎn)品。
3.2 掃描裝置LSCM使用的掃描裝置有兩類，臺掃描系統(tǒng)和鏡掃描系統(tǒng)?，F(xiàn)在也有兩者結(jié)合使用的儀器。臺掃描通過步進馬達驅(qū)動載物臺，位移精度可達0.lμm，能夠有效地消除成象點橫向象差，使樣品信號強度不受探測位置的影響，可準(zhǔn)確定位定量地掃描檢測視野中每一物點的光強度，缺點是載物臺機械移動、圖象采集速度較慢。鏡掃描有雙鏡掃描和單鏡掃描兩種，通轉(zhuǎn)鏡完成對樣品的掃描。由于轉(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍，圖象采集速度大大提高，512×512畫面每秒可達4幀以上，有利于那些壽命短的離子作熒光測定，但因光路略有偏轉(zhuǎn)會對通光效率和象差有所影響。掃描系統(tǒng)的工作程序由計算機自動控制。
3.3 激光光源
LSCM使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。氪氬離子激光器是可見光范圍內(nèi)使用的多光譜激光，發(fā)射波長488nm、568nm和647nm分別為藍光、綠光和紅光，大功率氬離子激光器是紫外和可見光混合激光器，發(fā)射波長為351－364nm、488nm和514nm分別為紫外光、藍光和綠光，單個激光優(yōu)點是安裝方便，光路簡單，但價格較貴并存在不同激光之間的光譜競爭和色差校正問題。多激光器系統(tǒng)在可見光范圍使用氬離子激光器，發(fā)射波長為 488nm和514nm的藍綠光，氦氖激光器發(fā)射波長為633nm的紅光，紫外光選用氬離子激光器，波長為351－364nm。其優(yōu)點是各譜線激光單獨發(fā)射，不存在譜線競爭的干擾，調(diào)節(jié)方便，但光路復(fù)雜，光學(xué)系統(tǒng)共軸準(zhǔn)直調(diào)試要求高。1996年新型雙光子激光器問世，利用雙光子倍頻效應(yīng)，使用可見光激光來代替紫外激光作激發(fā)光源達到檢測紫外探針的目的。雙光子激光能使活體細胞熒光損傷減少，成象質(zhì)量改善，增強對樣品深層的觀察能力。通過計算機控制的聲光調(diào)制器可進行各波長光譜之間高速切換以及迅速改變激光光斑、強度和照明時間。 3.4 檢測系統(tǒng)
LSCM為多通道熒光采集系統(tǒng)，光路上要求至少有三個熒光通道和一個透射光通道，如有第四熒光通道更好，可對物體進行多譜線激光激發(fā)，樣品發(fā)射熒光的探測器為感光靈敏度高的光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉(zhuǎn)換器，可以做光子計數(shù)。每個PMT前設(shè)置單獨的針孔，由計算機軟件調(diào)節(jié)針孔大小，光路中設(shè)有能自動切換的濾色片組，滿足不同測量的需要。通過在線視頻打印機或數(shù)字照相機可以實時拷貝圖象和制作幻燈。
4．LSCM的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用 Application of laser scanning confocal microscope in biomedicine
LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數(shù)，提供了光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)，使細胞生物學(xué)研究上了一個臺階。目前我們可以在亞細胞水平進行動態(tài)實驗，檢測細胞生物質(zhì)和離子通道的變化，觀察細胞在生理、病理和藥理情況下對外界因素作用所產(chǎn)生的快速反應(yīng)，進行定性、定量、定時和定位的分析測量。zui常用的功能是細胞三維重建，細胞熒光檢測和細胞顯微操作等。
4.1 細胞的三維重建（3-D Reconstruction）
普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖象結(jié)構(gòu)為多層面的圖象迭加，結(jié)構(gòu)不夠清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)毎M行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，經(jīng)A／D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組通過計算機進行不同的三維重建算法，可作單色圖象處理，雙色圖象處理，組合成細胞真實的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可不同的斷面觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量細胞的長寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過模擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。通過角度旋轉(zhuǎn)和細胞位置變化可產(chǎn)生三維動畫效果。LSCM的三維重建廣泛用于各類細胞骨架和形態(tài)學(xué)分析，染色體分析，細胞程序化死亡的觀察，細胞內(nèi)細胞質(zhì)和細胞器的結(jié)構(gòu)變化的分析和探測等方面。
4.2 細胞定量熒光測定
顯微熒光光度計由于顯微鏡和激發(fā)光源的限制成象模糊，只能測定細胞內(nèi)的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為光源，對細胞分層掃描，單獨測定，經(jīng)積分后能得到細胞熒光的準(zhǔn)確定量，重復(fù)性。它適于活細胞的定量分析，可測定細胞內(nèi)溶酶體、線粒體、DNA含量、RNA含量、酶和結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量和分布，常用于原位分子雜交，腫瘤細胞識別，單個活細胞水平的DNA損傷及修復(fù)的定量分析。它適于快速高靈敏度測量，減少光粹滅的影響，在定量免疫熒光測定方面應(yīng)用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達的定量分析，監(jiān)測腫瘤相關(guān)抗原表達的定位定量信息，監(jiān)測藥物對肌體免疫功能的作用，監(jiān)測自身免疫性疾病的多種抗原及藥物對肌體免疫功能的作用，監(jiān)測細胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)特征并作定量分析等。細胞定量熒光測定可選用單熒光。雙熒光和三熒光方式，能自動測定細胞面積，平均熒光強度，積分熒光強度及形狀因子等多種參數(shù)。 4.3 細胞內(nèi)鈣離子PH值和其它離子的動態(tài)分析
通過Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calcium green、SNARF等多種熒光探針，可對細胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及PH值等作熒光標(biāo)記并對它們進行比率值和濃度梯度變化測定。由于細胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對細胞生長分化起著重要作用，通過單標(biāo)記或雙標(biāo)記對細胞內(nèi)鈣離子和其它離子的熒光強度和分布測定，測定樣品達到毫秒級的快速變化。借助光學(xué)切片功能可以測量樣品深層的熒光分布以及細胞光學(xué)切片的生物化學(xué)特性的變化。通過不同時間段的檢測可測定細胞內(nèi)離子的擴散速率，了解它對腫瘤啟動因子、生長因子等刺激的反應(yīng)。細胞內(nèi)離子測量廣泛用于腫瘤研究、組織胚胎學(xué)、細胞生物學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域。
4.4 細胞胞間通訊（Cell Communication）和膜的流動性
動物和植物細胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊在細胞增殖和分化中起著重要作用。通過測量細胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用及細胞內(nèi)鈣離子、pH值等對縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測環(huán)境毒素和藥物在細胞增殖和分化中所起到的作用。選定經(jīng)熒光染色后的細胞，借助于光漂白作用或光損傷作用使細胞部分或整體不發(fā)熒光，實時觀察檢測熒光的恢復(fù)過程，可直接反應(yīng)細胞胞間通訊結(jié)果。
細胞膜的流動性在進行膜的磷脂酸組成分析，藥物作用點和藥物作用效應(yīng)，測定溫度反應(yīng)和物種比較方面有重要作用。細胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，這種有序的運動自由度取決于熒光分子周圍的膜流動性，所以極性測量能間接反映細胞膜的流動性。
4.5 熒光光漂白恢復(fù)（Fluorescence Redistribution After Photo bleaching，F(xiàn)RAP）
FRAP是用來測定活細胞的動力學(xué)參數(shù)，借助于高強度脈沖激光來照射細胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光粹滅，該區(qū)域周圍的非粹滅熒光分子會以一定的速率向受照射區(qū)域擴散，這個擴散速率可通過低強度激光掃描探測,因而可得到活細胞的動力學(xué)參數(shù)。LSCM可以控制光粹滅作用，實時監(jiān)測分子擴散率和恢復(fù)速率，反映細胞結(jié)構(gòu)和活動機制。廣泛用于研究細胞骨架構(gòu)成，核膜結(jié)構(gòu)跨膜大分子遷移率，細胞間通訊等領(lǐng)域。
4.6 籠鎖-解籠鎖測定（Caged-Uncaged）
這是一種光活化測定功能。生物活性產(chǎn)物或其它化合物處于籠鎖狀態(tài)時，其功能封閉，一旦被特異波長的瞬間光照射后，產(chǎn)生光活化解籠鎖，恢復(fù)原有的活性和功能，在細胞增殖分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。LSCM可以控制籠鎖探針的瞬間光分，選取特定的照射時間和波長，從而達到人為控制多種活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時間和空間作用。它們包括第二信使、核甘酸、神經(jīng)介質(zhì)、鈣離子。
4.7 粘附細胞分選（Adhered Cell Sort）和顯微手術(shù)（Micro-operation）
采用臺掃描方式的LSCM，由于激光束固定在顯微鏡的光軸上，可對載物臺上的樣品作地定位掃描，從而對所要選擇的細胞進行分選，Meridian公司的LSCM能夠理想地進行這項工作，在不改變細胞培養(yǎng)周圍環(huán)境，細胞鋪展程度和生長狀態(tài)情況下進行細胞分選。分選方法有兩種，一種是光刀切割法（Cookie－Cutter），將細胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，利用高能激光在所選細胞周圍作八角形切割，只在其間保留所選細胞，選擇條件取決于特定熒光和細胞形態(tài)學(xué)參數(shù)，這種分選方法特別適用于選擇數(shù)量較少的細胞，如突變細胞、轉(zhuǎn)移細胞和雜交瘤細胞等。第二種方法是激光消除法（Laser Ablation），用高能量激光自動殺滅不需要的細胞，留下完整的活細胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，這種方式取決于細胞熒光特性，特別適于對數(shù)量較多的細胞選擇。
通過這兩種方式可以總體掃描細胞群，進行細胞物理和生化特性的選擇。能對百萬分之一機率發(fā)生突變的細胞作篩選，能不改變細胞類型、形態(tài)和活性而克隆細胞，能分離細胞亞群并進行定量熒光檢測，能存儲細胞位置對特定細胞重復(fù)測定。這種細胞分選方式效率和度都很高。
借助LSCM我們可以把激光作為光子刀應(yīng)用，來完成細胞膜瞬間打孔，線粒體、溶酶體和染色體的切割，以及神經(jīng)元突起切割等顯微細胞外科手術(shù)。
4.8 激光光陷阱技術(shù)（Optical trap）
激光光陷阱技術(shù)又稱為光攝技術(shù)，就是利用光學(xué)梯度力形成的光陷阱，產(chǎn)生具有傳統(tǒng)機械鑷子挾持和操縱微小物體的功能。當(dāng)微米級范圍的顆粒落人一個非均勻光場中，它將趨于特定的平衡位置，如果沒有外界強有力的干擾，物體不會偏離光學(xué)中心。由于外界作用和粒子自身運動等原因產(chǎn)生的中心偏離也會很快恢復(fù)原位，光造成一個勢能較低的陷阱區(qū)域，當(dāng)物體的動能不能克服周圍勢壘時，它將留在陷阱內(nèi)。這種固定是光子動量的結(jié)果，與照明強度和波長直接有關(guān)。較大物體比較小的結(jié)構(gòu)需要更多的陷阱能量。光攝可以在保持處在生產(chǎn)環(huán)境中的細胞仍可與外界溝通的條件下，對目標(biāo)細胞進行非接觸式的捕獲與固定，井進行地操作，克服了以往單細胞操作中細胞難以固定和易產(chǎn)生機械損傷的弱點。這項新技術(shù)廣泛應(yīng)用于染色體移動，細胞器移動，細胞骨架彈性測量，細胞周期和調(diào)控研究及分子動力原研究等方面，尤其是在探測植物細胞骨架時，光陷阱是目前能探測其彈性和流變性的*技術(shù)。
綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細胞水平上可作多種功能測量和分析，成為分析細胞學(xué)的一項重要研究手段。目前LSCM價格一般報價為150萬至300萬左右，用戶基本集中在中科院系統(tǒng)和高等院校，隨著LSCM設(shè)備和應(yīng)用技術(shù)的不斷完善，它在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域里將起到更重要的作用，應(yīng)用前景非常廣泛激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用